आणविक निदान, सामान्यतया प्रयोग गरिएको PCR प्रविधि र सिद्धान्त

PCR, पोलिमरेज चेन प्रतिक्रिया हो, जसले DNA पोलिमरेजको उत्प्रेरक अन्तर्गत प्रणालीमा dNTP, Mg2+, विस्तार कारकहरू र एम्प्लीफिकेशन बृद्धि कारकहरूको थपलाई जनाउँछ, टेम्प्लेटको रूपमा अभिभावक DNA र विस्तारको सुरूवात बिन्दुको रूपमा विशिष्ट प्राइमरहरू प्रयोग गरेर, डिनेच्युरेसन, एनेलिङ, एक्सटेन्सन, आदिका चरणहरू मार्फत, इन भिट्रो प्रतिकृति गर्ने बेटी स्ट्र्यान्ड DNA को पूरक स्ट्र्यान्ड टेम्प्लेट DNA को प्रक्रियाले छिटो र विशेष रूपमा भिट्रोमा कुनै पनि लक्षित DNA विस्तार गर्न सक्छ।

1. हट स्टार्ट PCR

परम्परागत पीसीआरमा प्रवर्द्धन सुरु हुने समय पीसीआर मेसिनमा पीसीआर मेसिन राख्नु हुँदैन, र त्यसपछि कार्यक्रम विस्तार गर्न थाल्छ।जब प्रणाली कन्फिगरेसन पूरा हुन्छ, प्रवर्धन सुरु हुन्छ, जसले गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको कारण हुन सक्छ, र हट-स्टार्ट PCR ले यो समस्या समाधान गर्न सक्छ।

हट स्टार्ट PCR भनेको के हो?प्रतिक्रिया प्रणाली तयार भएपछि, इन्जाइम परिमार्जक प्रतिक्रियाको प्रारम्भिक तताउने चरण वा "हट स्टार्ट" चरणमा उच्च तापक्रम (सामान्यतया 90 डिग्री सेल्सियस भन्दा बढी) मा जारी गरिन्छ, ताकि DNA पोलिमरेज सक्रिय हुन्छ।सही सक्रियता समय र तापमान DNA पोलिमरेज र हट-स्टार्ट परिमार्जक को प्रकृति मा निर्भर गर्दछ।यो विधिले मुख्यतया परिमार्जकहरू जस्तै एन्टिबडीहरू, एफिनिटी लिगान्डहरू, वा रासायनिक परिमार्जकहरू DNA पोलिमरेजको गतिविधिलाई रोक्न प्रयोग गर्दछ।DNA पोलिमरेजको गतिविधि कोठाको तापक्रममा रोकिएको हुनाले, हट स्टार्ट टेक्नोलोजीले PCR प्रतिक्रियाहरूको विशिष्टतालाई त्याग नगरी कोठाको तापक्रममा धेरै PCR प्रतिक्रिया प्रणालीहरू तयार गर्न ठूलो सुविधा प्रदान गर्दछ।

2. RT-PCR

RT-PCR (रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR) mRNA बाट cDNA मा रिभर्स ट्रान्सक्रिप्सन र प्रवर्धनको लागि टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गर्ने प्रयोगात्मक प्रविधि हो।प्रयोगात्मक प्रक्रिया भनेको तन्तु वा कोशिकाहरूमा पहिले कुल आरएनए निकाल्नु हो, ओलिगो (dT) लाई प्राइमरको रूपमा प्रयोग गर्नुहोस्, cDNA संश्लेषण गर्न रिभर्स ट्रान्सक्रिप्टेस प्रयोग गर्नुहोस्, र त्यसपछि लक्ष्य जीन प्राप्त गर्न वा जीन अभिव्यक्ति पत्ता लगाउन PCR प्रवर्धनको लागि टेम्प्लेटको रूपमा cDNA प्रयोग गर्नुहोस्।

3. फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक PCR

फ्लोरोसेन्ट मात्रात्मक पीसीआर (वास्तविक-समय मात्रात्मक पीसीआर,RT-qPCR) ले PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमा फ्लोरोसेन्ट समूहहरू थप्ने विधिलाई जनाउँछ, वास्तविक समयमा सम्पूर्ण PCR प्रक्रियाको निगरानी गर्न फ्लोरोसेन्ट सङ्केतहरूको सङ्कलन प्रयोग गरेर, र अन्तमा टेम्प्लेटलाई मात्रात्मक रूपमा विश्लेषण गर्न मानक वक्र प्रयोग गर्ने।सामान्यतया प्रयोग गरिने qPCR विधिहरूमा SYBR Green I र TaqMan समावेश छन्।

4. नेस्टेड PCR

नेस्टेड PCR भन्नाले PCR प्रवर्द्धनका दुई राउन्डका लागि PCR प्राइमरहरूको दुई सेटको प्रयोगलाई जनाउँछ, र दोस्रो राउन्डको एम्प्लीफिकेशन उत्पादन लक्षित जीन खण्ड हो।

यदि प्राइमरको पहिलो जोडी (बाहिरी प्राइमरहरू) को बेमेलले गैर-विशिष्ट उत्पादनलाई एम्प्लीफाइड बनाउँछ भने, एउटै गैर-विशिष्ट क्षेत्रलाई दोस्रो जोडी प्राइमरहरूले पहिचान गर्ने र प्रवर्द्धन जारी राख्ने सम्भावना धेरै सानो छ, त्यसैले प्राइमरको दोस्रो जोडी द्वारा प्रवर्धन, PCR को विशिष्टता सुधारिएको छ।PCR को दुई राउन्ड प्रदर्शन गर्ने एउटा फाइदा यो हो कि यसले सीमित सुरुवाती DNA बाट पर्याप्त उत्पादन बढाउन मद्दत गर्दछ।

5. टचडाउन PCR

Touchdown PCR PCR चक्र प्यारामिटरहरू समायोजन गरेर PCR प्रतिक्रियाको विशिष्टता सुधार गर्ने तरिका हो।

टचडाउन PCR मा, पहिलो केही चक्रहरूको लागि एनिलिङ तापक्रम प्राइमरहरूको अधिकतम एनेलिङ तापक्रम (Tm) भन्दा केही डिग्री माथि सेट गरिएको छ।उच्च एनिलिङ तापक्रमले गैर-विशिष्ट प्रवर्धनलाई प्रभावकारी रूपमा कम गर्न सक्छ, तर एकै समयमा, उच्च एनेलिङ तापक्रमले प्राइमरहरू र लक्ष्य अनुक्रमहरूको विभाजनलाई बढाउँछ, परिणामस्वरूप PCR उपज कम हुन्छ।तसर्थ, पहिलो केही चक्रहरूमा, प्रणालीमा लक्षित जीनको सामग्री बढाउनको लागि एनेलिङ तापमान सामान्यतया 1 डिग्री सेल्सियस प्रति चक्रले घटाउन सेट गरिन्छ।जब annealing तापमान इष्टतम तापमान मा कम हुन्छ, annealing तापमान बाँकी चक्र को लागी राखिएको छ।

6. प्रत्यक्ष PCR

प्रत्यक्ष PCR ले न्युक्लिक एसिड अलगाव र शुद्धिकरणको आवश्यकता बिना नमूनाबाट सीधा लक्ष्य डीएनएको प्रवर्धनलाई जनाउँछ।

त्यहाँ दुई प्रकारका प्रत्यक्ष PCR छन्:

प्रत्यक्ष विधि: थोरै मात्रामा नमूना लिनुहोस् र पीसीआर पहिचानको लागि सीधा पीसीआर मास्टर मिक्समा थप्नुहोस्;

क्र्याकिंग विधि: नमूनाको नमूना लिएपछि, यसलाई लाइसेटमा थप्नुहोस्, जीनोम रिलिज गर्न लाइसे, थोरै मात्रामा लाइसेड सुपरनेटान्ट लिनुहोस् र यसलाई पीसीआर मास्टर मिक्समा थप्नुहोस्, पीसीआर पहिचान गर्नुहोस्।यो दृष्टिकोणले प्रयोगात्मक कार्यप्रवाहलाई सरल बनाउँछ, ह्यान्ड्स-अन समय कम गर्छ, र शुद्धीकरण चरणहरूमा DNA नोक्सानबाट बच्न सक्छ।

7. SOE PCR

ओभरल्याप एक्सटेन्सन PCR (SOE PCR) द्वारा जीन स्प्लिसिङले PCR उत्पादनहरू ओभरल्यापिङ चेनहरू बनाउनको लागि पूरक छेउहरूसँग प्राइमरहरू प्रयोग गर्दछ, ताकि पछिल्ला प्रवर्द्धन प्रतिक्रियामा, ओभरल्यापिङ चेनहरूको विस्तार मार्फत, एम्प्लीफाइड टुक्राहरू ओभरल्याप गरिएका विभिन्न स्रोतहरू। र सँगै विभाजित।यस प्रविधिमा हाल दुईवटा मुख्य प्रयोग दिशाहरू छन्: फ्युजन जीनहरूको निर्माण;जीन साइट निर्देशित उत्परिवर्तन।

8. IPCR

Inverse PCR (IPCR) ले दुई प्राइमरहरू बाहेक अन्य DNA टुक्राहरूलाई विस्तार गर्न रिभर्स पूरक प्राइमरहरू प्रयोग गर्दछ, र ज्ञात DNA खण्डको दुबै छेउमा अज्ञात अनुक्रमहरू विस्तार गर्दछ।

आईपीसीआर मूल रूपमा छेउछाउका अज्ञात क्षेत्रहरूको अनुक्रम निर्धारण गर्न डिजाइन गरिएको थियो, र प्रायः जीन प्रमोटर अनुक्रमहरू अध्ययन गर्न प्रयोग गरिन्छ;ओन्कोजेनिक क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था, जस्तै जीन फ्यूजन, ट्रान्सलोकेशन र ट्रान्सपोजिसन;र भाइरल जीन एकीकरण, पनि सामान्यतया प्रयोग गरिन्छ साइट-निर्देशित mutagenesis को लागि, इच्छित उत्परिवर्तन संग प्लाज्मिड प्रतिलिपि गर्नुहोस्।

9. dPCR

डिजिटल पीसीआर (डीपीसीआर) न्यूक्लिक एसिड अणुहरूको पूर्ण परिमाणीकरणको लागि एक प्रविधि हो।

न्यूक्लिक एसिड अणुहरूको परिमाणीकरणका लागि हाल तीनवटा विधिहरू छन्।फोटोमेट्री न्यूक्लिक एसिड अणुहरूको अवशोषणमा आधारित छ;वास्तविक-समय फ्लोरोसेन्ट परिमाणात्मक PCR (रियल टाइम PCR) Ct मानमा आधारित छ, र Ct मानले पत्ता लगाउन सकिने फ्लोरोसेन्स मानसँग सम्बन्धित चक्र नम्बरलाई जनाउँछ;डिजिटल PCR एकल-मोलिक्युल PCR विधिमा आधारित नवीनतम मात्रात्मक प्रविधि हो जुन न्यूक्लिक एसिड मात्रा गणना गर्नको लागि एक निरपेक्ष मात्रात्मक विधि हो।