अल्ट्राफिल्ट्रेशन सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबको प्रयोग र सावधानीहरू
१) उपयुक्त अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब छान्नुहोस्।ध्यान दिनुहोस् कि UF झिल्लीहरू विभिन्न रसायनहरूमा सहिष्णुताको स्तरमा भिन्न हुन्छन्।सामान्यतया, 10 kDa आणविक वजन कट-अफ भएको अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबहरू एक आणविक वजन कट-अफसँग चयन गर्न सकिन्छ जुन रुचिको प्रोटीनको आणविक वजनको 1/3 भन्दा बढी हुनु हुँदैन, जस्तै 35 kDa।यदि रुचिको प्रोटिनको आणविक वजन लगभग 10 kd छ भने, 3 KD को आणविक वजन कट-अफ भएको अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब प्रयोग गर्न सकिन्छ।
(२) अल्ट्राफिल्ट्रेसन, भर्खरै किनेको, सुक्खा हुन्छ, प्रयोग गर्नु अघि अल्ट्राप्योर पानी थपिएको हुन्छ र पानी पूर्ण रूपमा झिल्ली, आइस बाथ वा फ्रिजबाट केही मिनेटको लागि पूर्व चिसो हुन्छ।त्यसपछि पानी खन्याइन्छ, अर्थात् प्रोटिन तरल पदार्थ, र ट्यूबको शीर्षमा सेतो रेखा भन्दा बढी नभई कति थपिन्छ।अपरेशन हल्का छ, र प्रोटिन घोल थप्नु अघि अल्ट्राफिल्ट्रेसन ट्यूबलाई बरफमा प्रिकुल गर्न आवश्यक छ।
3) गुरुत्वाकर्षणको द्रव्यमान र केन्द्र दुवै सन्तुलनमा पुग्नु थियो।ध्यान दिनुहोस् कि घूर्णन गति र प्रवेग धेरै छिटो हुँदैन, अन्यथा अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्लीलाई सीधै क्षति पुर्याउँछ।सेन्ट्रीफ्यूगल अल्ट्राफिल्ट्रेशन सुरु भयो (सेन्ट्रीफ्यूजलाई 4 डिग्रीमा पूर्व कूल गरिएको)।विभिन्न सेन्ट्रीफ्यूजहरूको RPM लाई g मा रूपान्तरण गरेपछि, यो फरक थियो।सेन्ट्रीफ्यूजको प्रवेगलाई न्यूनतममा समायोजन गरियो, झिल्लीमा दबाब कम गर्दै।नोट, सेन्ट्रीफ्यूज आफ्नो गन्तव्य गतिमा पुगेपछि सेन्ट्रीफ्यूज छोड्न निश्चित हुनुहोस्, वा यदि तपाईंलाई समस्या छ भने, तपाईंले यसलाई पहिलो पटक ह्यान्डल गर्न सक्नुहुन्न।स्पिन्डलमा झिल्लीको अभिमुखीकरण निर्देशनहरू अनुसार समायोजित गरिएको थियो (कोणीय सेन्ट्रीफ्यूज केस झिल्ली अक्ष लम्बाइ हो)।व्यावहारिक प्रयोगमा, सामान्य घुमाउने गति निर्देशनहरूमा भन्दा कम छ, ताकि सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबको जीवन विस्तार गर्न सकिन्छ।
3) गुरुत्वाकर्षणको द्रव्यमान र केन्द्र दुवै सन्तुलनमा पुग्नु थियो।ध्यान दिनुहोस् घूर्णन गति र प्रवेग धेरै छिटो हुँदैन, अन्यथा अल्ट्राफिल्ट्रेसन झिल्लीलाई सीधै क्षति पुर्याउँछ।सेन्ट्रीफ्यूगल अल्ट्राफिल्ट्रेसन सुरु भयो (सेन्ट्रीफ्यूजलाई ४ डिग्रीमा पूर्व कूल गरिएको)।विभिन्न सेन्ट्रीफ्यूजहरूको RPM लाई g मा रूपान्तरण गरेपछि, यो फरक थियो।सेन्ट्रीफ्यूजको प्रवेगलाई न्यूनतममा समायोजन गरिएको थियो, झिल्लीमा दबाब कम गर्दै।नोट, सेन्ट्रीफ्यूज आफ्नो गन्तव्य गतिमा पुगेपछि सेन्ट्रीफ्यूज छोड्न निश्चित हुनुहोस्, वा यदि तपाईंलाई समस्या छ भने, तपाईंले यसलाई पहिलो पटक ह्यान्डल गर्न सक्नुहुन्न।स्पिन्डलमा झिल्लीको अभिमुखीकरण निर्देशनहरू अनुसार समायोजित गरिएको थियो (कोणीय सेन्ट्रीफ्यूज केस झिल्ली अक्ष लम्बाइ हो)।व्यावहारिक प्रयोगमा, सामान्य घुमाउने गति निर्देशनहरूमा भन्दा कम छ, ताकि सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबको जीवन विस्तार गर्न सकिन्छ।
(4) बाँकी 1ml मा केन्द्रित हुँदा, 50ul बफर समाधान लिनुहोस्, 10ul प्रवाह थप्नुहोस् र अल्ट्राफिल्ट्रेसन ट्यूबमा प्रोटिन हराइरहेको छ कि छैन भनेर निर्णयको रूपमा कुनै नीलो रङ छ कि छैन हेर्नुहोस्।यदि ट्यूब चुहावट छ भने, माथिल्लो तहलाई पुन: खन्याउनुहोस् र अल्ट्राफिल्ट्रेसन सुरु गर्न नयाँ ट्यूबमा प्रवाह गर्नुहोस्।ट्युब छुटेको छ कि छैन भनेर यकिन गर्न, फ्लोथ्रु अघि 5mgml BSA सहित 10 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज, प्रोटीन ग्लु वा ब्राडफोर्ड कच्चा एसेमा चलिरहेको छ, र बाँकी केन्द्रित प्रोटीन समाधान (जसले बरफमा काम गर्छ र प्रोटिनलाई तताउनबाट रोक्छ) थपेर जारी राख्छ। सबै सांद्रता थपिएको छ।सेन्ट्रीफ्युगेशनको समयमा सावधान रहनुहोस् यदि प्रोटीनको वर्षा हुन्छ, जसले ट्यूब बन्द हुन्छ।यदि वर्षा हुन्छ भने, निर्धारण गर्नुहोस् कि वर्षाको विशिष्ट कारण अत्यधिक प्रोटीन एकाग्रता वा अनुपयुक्त बफर हो;पहिलोलाई एकै पटक धेरै अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबहरूको अल्ट्राफिल्ट्रेशनद्वारा समाधान गर्न सकिन्छ, एकाग्रता घटाएर, र पछिल्लोलाई विभिन्न बफर समाधानहरू साटासाट गरेर प्रोटीनको कुनै वर्षा नहुँदासम्म समाधान गर्न सकिन्छ।
(4) बाँकी 1ml मा केन्द्रित हुँदा, 50ul बफर समाधान लिनुहोस्, 10ul प्रवाह थप्नुहोस् र अल्ट्राफिल्ट्रेसन ट्यूबमा प्रोटिन हराइरहेको छ कि छैन भनेर निर्णयको रूपमा कुनै नीलो रङ छ कि छैन हेर्नुहोस्।यदि ट्यूब चुहावट छ भने, अल्ट्राफिल्ट्रेसन सुरु गर्नको लागि माथिल्लो तहलाई फेरि हाल्नुहोस् र नयाँ ट्यूबमा प्रवाह गर्नुहोस्।ट्युब छुटेको छ कि छैन भनेर यकिन गर्न, फ्लोथ्रु अघि 5mgml BSA सहित 10 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज, प्रोटीन ग्लु वा ब्राडफोर्ड कच्चा एसेमा चलिरहेको छ, र बाँकी केन्द्रित प्रोटीन समाधान (जसले बरफमा काम गर्छ र प्रोटिनलाई तताउनबाट रोक्छ) थपेर जारी राख्छ। सबै सांद्रता थपिएको छ।सेन्ट्रीफ्युगेशनको समयमा सावधानी लिनुहोस् यदि प्रोटीनको वर्षा हुन्छ, जसले ट्यूब बन्द हुन्छ।यदि वर्षा हुन्छ भने, निर्धारण गर्नुहोस् कि वर्षाको विशिष्ट कारण एक अत्यधिक प्रोटीन एकाग्रता वा अनुपयुक्त बफर हो;पहिलोलाई एकै पटक धेरै अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबहरूको अल्ट्राफिल्ट्रेशनद्वारा समाधान गर्न सकिन्छ, एकाग्रता घटाएर, र पछिल्लोलाई विभिन्न बफर समाधानहरू साटासाट गरेर प्रोटीनको कुनै वर्षा नहुँदासम्म समाधान गर्न सकिन्छ।
(५) प्रोटिनलाई केन्द्रित गर्नका लागि सुरुका केही चरणहरू प्रयोग गरिन्छ, र यदि बफर परिवर्तन गर्ने हो भने, बिस्तारै नयाँ बफर थप्नुहोस् (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेसन झिल्ली मार्फत अल्ट्राफिल्ट्रेसन) कुल प्रोटीनको लगभग 1ml मा, र तीनको लागि लगभग 1ml मा पुन: केन्द्रित गर्नुहोस्। लगातार पटक, वांछित प्रोटीन एकाग्रताको आधारमा अन्तिम केन्द्रित अन्तिम मात्राको साथ, सामान्यतया 500ul भन्दा बढी होइन, तर 200ul भित्र पनि।1000 × वा बढी तीन अवसरहरूमा प्राप्त गर्नुहोस्, अनिवार्य रूपमा धेरै बफर परिवर्तन, प्रत्येक पटक कम्तिमा 10 × वा सो भोल्युम संवर्धन द्वारा गणना गरे अनुसार।
(५) प्रोटिनलाई केन्द्रित गर्नका लागि सुरुका केही चरणहरू प्रयोग गरिन्छ, र यदि बफर परिवर्तन गर्ने हो भने, बिस्तारै नयाँ बफर (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेसन झिल्ली मार्फत अल्ट्राफिल्ट्रेसन) कुल प्रोटीनको लगभग 1ml मा थप्नुहोस्, र तीनको लागि लगभग 1ml मा पुन: केन्द्रित गर्नुहोस्। लगातार पटक, वांछित प्रोटीन एकाग्रताको आधारमा अन्तिम केन्द्रित अन्तिम मात्राको साथ, सामान्यतया 500ul भन्दा बढी होइन, तर 200ul भित्र पनि।1000 × वा बढी तीन अवसरहरूमा प्राप्त गर्नुहोस्, अनिवार्य रूपमा धेरै बफर परिवर्तन, प्रत्येक पटक कम्तिमा 10 × वा सो भोल्युम संवर्धन द्वारा गणना गरे अनुसार।
पोस्ट समय: नोभेम्बर-०९-२०२२